L'expédition, en partance vers la galaxie de Pégase et dirigée par le docteur Weir, s'installe dans la cité des Anciens. Elle se voit toutefois rapidement contrainte, pour des raisons techniques menaçant la cité et la vie du personnel, de l'abandonner pour partir à la recherche d'une nouvelle planète. Un groupe d'hommes fait la rencontre de nouveaux alliés, les Athosiens. Malheureusement pour l'expédition, ils vont aussi découvrir un nouvel ennemi : les Wraiths, alors que les explorateurs terriens essaient de sauver certains d'entre eux. Après le réveil de ces nouveaux ennemis dans la galaxie et l'emménagement dans la cité, le docteur Weir et le Major Sheppard ont fort à faire pour repousser les Wraiths, mais aussi les Géniis et d'autres menaces rendant difficiles l'exploration de la galaxie. La vie sur Atlantis n'est pas aussi idyllique que tous l'espéraient et les combats sont difficiles et douloureux pour protéger la ville des Anciens qui finit quand même par être assiégée à la fin de la saison.

L'histoire suit directement la fin de la première saison, la cité est sauvée avec l'arrivée du vaisseau terrien Dédale et les Wraiths croient que Atlantis a été détruite par une explosion nucléaire. Ronon Dex rejoint l'équipe de Sheppard en remplacement du lieutenant Ford qui est contaminé par une toxine Wraith transformant le lieutenant en véritable machine de guerre. Sheppard et son équipe visitent de nouvelles planètes où ils découvrent de nouvelles technologies anciennes plus ou moins bonnes et font la connaissance de nouveaux peuples dont un qui a mis au point un virus capable de tuer les Wraiths. Le Docteur Beckett expérimente ce rétrovirus et le transforme. L'arme biologique d'Atlantis permet de transformer des Wraiths en humains. Ils font un test sur un Wraith qu'il prénomme Michael mais ce dernier parvient à leur échapper et fait route vers la Terre avec plusieurs vaisseaux.

Cette nouvelle saison reprend là où la 2e saison s'est terminée. Les Wraiths qui se rendent sur Terre sont arrêtés, mais le prix est lourd : l'Orion est détruit. L'expédition fait la connaissance d'un nouveau peuple qu'ils prennent pour les Anciens : les Asurans. Ces derniers se révèlent être des Réplicateurs à forme humaine créés par les Anciens. Les Asurans vouent une véritable haine pour les Anciens et décident de détruire Atlantis ainsi que ses occupants. Le Docteur Weir et son équipe finissent par rencontrer des Anciens en sauvant certains d'entre eux d'un vaisseau à la dérive. Les derniers survivants de la civilisation ancienne décident de reprendre le contrôle d'Atlantis mais O'Neill et Richard Woolsey tentent de négocier un accord entre la Terre et les Anciens afin de permettre le retour de l'expédition. Pendant les négociations, les Asurans s'emparent à leur tour de la cité en tuant tous les Anciens. Les principaux membres de l'expédition Atlantis sur Terre vont désobéir aux ordres et retourner sur Atlantis, afin de sauver O'Neill et Richard Woolsey et de détruire les Asurans présents. Plus tard, le vaisseau terrien Apollo attaque des chantiers Asurans. Ces derniers contre-attaquent en utilisant un puissant rayon tiré depuis l'espace à l'aide d'une porte des étoiles. La situation est catastrophique car les boucliers ne pourront pas supporter la puissance du rayon. Sheppard, Weir et Rodney décident de faire décoller la cité de la planète. Mais au dernier moment, le rayon des réplicateurs parvient à toucher la cité endommageant sévèrement la tour principale et blessant ses occupants, notamment Elisabeth Weir…

La cité est fortement endommagée et toujours à la dérive dans l'espace. Le Docteur Weir est blessée et ses jours sont maintenant comptés. Rodney réactive les nanites endormies dans le corps d'Elisabeth et cette dernière accompagne Sheppard pour récupérer un E2PZ sur la planète des Asurans afin de pouvoir sauver la Cité et ses occupants. Mais Elisabeth est faite prisonnière après que McKay a reprogrammé les Réplicateurs pour qu'ils s'attaquent de nouveau aux Wraiths. Pour remplacer Elisabeth, le Colonel Samantha Carter est désignée et elle devient la nouvelle chef de l'expédition. Par la suite, les Asurans deviennent une plus grande menace pour les peuples de Pégase que les Wraiths car depuis que McKay les a reprogrammé pour qu'ils s'attaquent aux Wraiths, les Asurans s'attaquent directement à leur nourriture, c'est-à-dire : le peuple de Pégase. Les réplicateurs et leur planète sont détruits avec l'aide de plusieurs peuples, notamment les Wraiths, qui apportent leur aide à Atlantis. De son côté, Teyla apprend qu'elle est enceinte et découvre la disparition de tout son peuple qu'elle retrouve lorsque Michael réussit à la kidnapper et à la conduire dans son repaire ; ceci afin de finaliser ses recherches génétiques pour combiner les ADN humain et wraith et ainsi parfaire la troupe d'hybrides qu'il s'est constituée dans le but de prendre le contrôle de la galaxie tout en se débarrassant des Wraiths grâce à la protéine Hoffan qu'il s'est procurée...

Teyla est sur le croiseur de Michael qui se dirige vers sa base qui vient d'exploser. Avec l'aide du Dédale, Sheppard, Ronon et Rodney parviennent à sauver leur amie ainsi que son bébé avant que le croiseur n'explose laissant planer le doute sur la mort de Michael. Le docteur Keller trouve le remède pour sauver le docteur Beckett qui repart sur terre pour se reposer. Richard Woolsey qui remplace le colonel Carter tente tant bien que mal de conserver son poste en gérant les crises qui surviennent les unes derrière les autres. Daniel Jackson rejoint Atlantis pour étudier les travaux d'un Ancien appelé Janus, mais il est kidnappé avec Rodney par des Asgards qui vivent dans la galaxie de Pégase et qui veulent éradiquer les Wraiths en utilisant un appareil destiné à détruire les vaisseaux Wraiths ou à les immobiliser dans l'espace. Par la suite Michael revient sur Atlantis pour enlever Teyla et son fils, mais la jeune femme parvient à éliminer son ennemi pour de bon. Quelque temps après, Atlantis apprend qu'un vaisseau ruche équipé d'un E2PZ se dirige vers la Terre. Todd, qui a informé ses alliés, leur fournit deux E2PZ pour que la cité puisse se rendre dans la Voie lactée et défendre la Terre...