O primeiro piloto de Star Trek, "The Cage", foi completado entre novembro de 1964 e janeiro de 1965, e era estrelado por Jeffrey Hunter como Capitão Christopher Pike, Majel Barrett como Número Um e Leonard Nimoy como Spock. Depois de ser rejeitado pela NBC por ser "cerebral demais" (entre outras reclamações), Jeffrey Hunter decidiu sair do papel de Pike quando Roddenberry recebeu a encomenda para produzir um segundo episódio piloto ("Where No Man Has Gone Before"), com uma versão editada indo ao ar em 1966. "The Cage" nunca foi ao ar durante a exibição original de Star Trek na NBC. Ele foi apresentado por Roddenberry como uma versão inacabada em branco e preto durante várias convenções de ficção científica nos anos posteriores ao cancelamento de Star Trek, porém não foi lançado em home video até 1986, quando a Paramount Home Video produziu um lançamento "restaurado" de "The Cage" (uma combinação das imagens originais em branco e preto com as porções coloridas do episódio "The Menagerie" da primeira temporada), completada por uma introdução de Roddenberry. Em 4 de outubro de 1988, a Paramount Pictures exibiu um especial de duas horas, apresentado por Patrick Stewart, chamado "The Star Trek Saga: From One Generation To The Next" que tinha, pela primeira vez, uma apresentação totalmente colorida de "The Cage". Em alguns mercados, o especial não foi ao ar até 15 de outubro de 1988. Nos Estados Unidos, "The Cage" foi lançado em DVD pela primeira vez em dezembro de 2001. Ele foi mais tarde incluído no disco final das caixas de DVD original e remasterizada da terceira temporada (listado com a data de exibição original de 15 de outubro de 1988).

Depois do segundo piloto de Roddenberry, "Where No Man Has Gone Before", ter recebido uma resposta mais favorável da NBC, Star Trek finalmente foi ao ar com seu primeiro episódio – "The Man Trap" – às 20h30 do dia 8 de setembro de 1966. "Where No Man...", que eventualmente foi ao ar como o terceiro episódio da série, retinha apenas o personagem Spock de "The Cage", porém introduziu William Shatner como Capitão Kirk, James Doohan como o Engenheiro Chefe Scotty e George Takei como o físico (mais tarde piloto) Sulu. DeForest Kelley e Nichelle Nichols se juntaram ao elenco como o Oficial Médico Chefe Dr. McCoy e a Oficial de Comunicações Uhura em "The Man Trap". Apesar de sua personagem Número Um não ter sido mantida depois de "The Cage", Majel Barrett retornou para o programa como uma nova personagem, enfermeira Christine Chapel, e fez sua primeira de muitas aparições recorrentes em "The Naked Time". Grace Lee Whitney apareceu em oito episódios como ordenança Janice Rand, começando com "The Man Trap". Whitney deixou a série após "The Conscience of the King", porém faria aparições rápidas no primeiro, terceiro, quarto e sexto filmes da franquia, como também no episódio "Flashback" de Star Trek: Voyager. A primeira temporada de Star Trek compreende 29 episódios, incluindo o episódio em duas partes "The Menagerie", que inclui muito das imagens do piloto original, "The Cage". Outros episódios notáveis incluem "Balance of Terror", que introduz os romulanos; "Space Seed", que introduz Khan Noonien Singh e serve como base para Star Trek II: The Wrath of Khan; "Errand of Mercy", onde os klingons fazem sua primeira aparição; e o aclamado pela crítica, episódio vencedor do Hugo Award, "The City on the Edge of Forever", que mostra Kirk, Spock e McCoy viajando para o passado através do Guardião da Eternidade.

A segunda temporada de 26 episódios do programa começou em setembro de 19672 com "Amok Time", que introduziu o ator Walter Koenig como o navegador russo Pavel Chekov, e deu aos espectadores o primeiro vislumbre do mundo natal de Spock, Vulcano. A temporada também inclui episódios notáveis como "Mirror, Mirror", que introduz o "Universo Espelho"; "Journey to Babel", contendo a introdução dos pais de Spock, Sarek e Amanda; e o cômico "The Trouble With Tribbles", que mais tarde seria revisitado em um episódio de Star Trek: The Animated Series e um de Star Trek: Deep Space Nine.

Depois de sua segunda temporada, a NBC estava preparada para cancelar Star Trek devido aos baixos indíceis de audiência. Liderados pelos fãs Bjo e John Trimble, os telespectadores de Trek inundaram a NBC com cartas protestando contra o cancelamento da série e pedindo para a emissora renovar o programa para mais um ano. Depois da NBC ter concordado em produzir uma terceira temporada, ela prometeu a Gene Roddenberry que o programa iria ao ar em um horário favorável (segundas-feiras, às 19h30), porém mais tarde mudou a programação e colocou Star Trek no chamado "horário da morte" – sextas-feiras, às 22h00. Além da troca de horário na programação, o orçamento do programa foi "seriamente cortado" e Nichelle Nichols descreveu o eventual concelamento da série como "uma profecia auto-realizável" A temporada final de 24 episódios de Star Trek começou em setembro de 1968 com "Spock's Brain". A terceira temporada também inclui "The Tholian Web", onde Kirk fica preso entre dois universos; este episódio seria revisitado em 2005 no episódio em duas partes "In a Mirror, Darkly", da série prequela Star Trek: Enterprise. O último episódio da série, "Turnabout Intruder", foi exibido em 3 de junho de 1969, porém Star Trek acabaria por voltar a televisão na forma de animação quando Star Trek: The Animated Series estreou em setembro de 1973.